1. سیل کی بحالی
مائع نائٹروجن سے cryopreserved خلیوں کو ہٹانے کے بعد، انہیں 37 ڈگری پانی کے غسل میں مسلسل ہلاتے ہوئے پگھلا دیا گیا۔ پگھلے ہوئے خلیوں کو سینٹری فیوج ٹیوب میں منتقل کریں، 37 ڈگری پر پہلے سے گرم DMEM مکمل میڈیم شامل کریں (جس میں فیٹل بوائن سیرم تقریباً 10 فیصد ہے)، آہستہ سے یکساں طور پر پھونکیں، 2 منٹ کے لیے 500 گرام پر سینٹری فیوج کریں، اور سپرنیٹنٹ کو ضائع کریں۔
سپرنٹنٹ کو دھونے اور ضائع کرنے کے لیے DMEM مکمل میڈیم شامل کریں۔ DMEM مکمل میڈیم شامل کریں، پائپٹنگ کے ذریعے آہستہ سے مکس کریں، سیل سسپنشن بنائیں، اسے پیٹری ڈش/فلاسک میں ٹیکہ لگائیں، اور سیل انکیوبیٹر میں کلچر کریں جس میں 5 فیصد CO2 ہو۔
2. سیل گزرنا
جب سیل کی کثافت 80 فیصد ~ 90 فیصد تک پہنچ جاتی ہے (قبل از وقت پیداوار ناکافی ہوتی ہے، بہت دیر سے خلیات خراب حالت میں ہوتے ہیں، ذیلی ثقافت 1:2 سے 1:10 یا اس سے زیادہ کے تناسب سے، عام طور پر 1:3 سے 1:5 سیل کی نسل، یعنی سیل ٹیکہ لگانے سے علیحدگی اور دوبارہ کاشت کے وقت، مکمل میڈیم کو ہٹا دیا گیا اور 1X PBS کے ساتھ دو بار دھویا گیا۔
ٹرپسن شامل کریں (نوٹ: خلیات کو ڈھانپنے کے لیے عمل انہضام کے محلول کی مقدار بہترین ہے، اور زیادہ سے زیادہ ہاضمہ درجہ حرارت 37 ڈگری ہے۔ ایک خوردبین کے نیچے خلیات کا مشاہدہ کریں: الٹی خوردبین کے نیچے ہضم شدہ خلیوں کا مشاہدہ کریں، اگر سائٹوپلازم پیچھے ہٹ جائے تو خلیات اب ایک ساتھ جڑے ہوئے نہیں ہیں۔ سلائسز، جو اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ خلیات اس وقت صحیح طریقے سے ہضم ہو چکے ہیں)، انہیں ہضم کریں، اور انہیں سیل انکیوبیٹر میں تقریباً 2-3 منٹ کے لیے رکھیں۔
ٹرپسنائزیشن کو روکنے کے لیے مناسب مقدار میں ڈی ایم ای ایم مکمل میڈیم شامل کریں، سینٹری فیوج ٹیوب میں منتقل کریں اور 2 منٹ کے لیے 500 گرام پر سینٹری فیوج کریں، سپرنٹنٹ کو ضائع کریں، دھونے کے لیے DMEM مکمل میڈیم شامل کریں، اور سپرنیٹینٹ کو ضائع کریں۔
DMEM مکمل میڈیم شامل کریں، آہستہ سے پائپٹنگ کے ذریعے مکس کریں، گنتی کے لیے 10 مائیکرو لٹر پِیٹ کریں، اور پھر سیل انکیوبیٹر میں کلچر جاری رکھیں جس میں سیل کے مطلوبہ حجم کے مطابق 5 فیصد CO2 ہو۔
3. سیل cryopreservation
جب سیل کی کثافت 80 فیصد ~ 90 فیصد تک پہنچ جائے تو مکمل میڈیم کو ہٹا دیں اور 1X PBS کے ساتھ 2 بار دھو لیں۔ عمل انہضام کے لیے ٹرپسن شامل کریں اور سیل انکیوبیٹر میں تقریباً 2-3 منٹ تک رکھیں۔ ٹرپسن کے عمل انہضام کو روکنے کے لیے DMEM مکمل میڈیم شامل کریں، سینٹری فیوج ٹیوب میں منتقل کریں اور 2 منٹ کے لیے 500 گرام پر سینٹری فیوج کریں، سپرناٹینٹ کو ضائع کریں، دھونے کے لیے DMEM مکمل میڈیم شامل کریں، اور سپرناٹینٹ کو ضائع کریں۔ 1 ملی لیٹر فریزنگ سلوشن شامل کریں (90 فیصد فیٹل بوائین سیرم، 10 فیصد DMSO۔ عام طور پر، سیرم کے مواد کو 10 فیصد اور 90 فیصد کے درمیان ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے۔ منجمد محلول میں سیرم شامل کرنے سے ایک طرف خلیات کو غذائی اجزاء مل سکتے ہیں، اور دوسری طرف سیل کریوپریزرویشن کے دوران غیر پارگمی حفاظتی مادے فراہم کریں، جیسے کہ خلیوں کی بہتر حفاظت کے لیے سوکروز، البومین وغیرہ)، اسے کرائیو پریزرویشن ٹیوب میں ڈالیں (درجہ حرارت میں کمی کی رفتار کو یقینی بنانے کے لیے ٹیوب میں آئسوپروپل الکحل موجود ہے)، اسے فوری طور پر ڈال دیں۔ 4 ڈگری ریفریجریٹر میں 30 منٹ کے لیے منجمد کریں، پھر اسے 30 منٹ کے لیے -20 ڈگری فرج میں رکھیں، اور پھر رات بھر اسے -80 ڈگری فرج میں رکھیں۔
اگلے دن اسے مائع نائٹروجن میں ڈالیں، اسے کم از کم دو سال تک ذخیرہ کیا جا سکتا ہے، اور اگر آپ اسے مائع نائٹروجن میں نہیں ڈالیں تو اسے تین ماہ تک ذخیرہ کیا جا سکتا ہے۔
سیل کریوپریزرویشن اور ریکوری کا اصول یہ ہے: آہستہ سے جمنا اور پگھلنا، جو سیل کی عملداری کو برقرار رکھنے کے لیے زیادہ موزوں ہے۔ بغیر کسی حفاظتی ایجنٹ کے خلیوں کی کرائیو پریزرویشن انٹرا سیلولر آئس کرسٹل کی پیداوار کا باعث بنے گی، جو خلیوں کو اینڈوجینس میکانکی نقصان کا باعث بنیں گے، انٹرا سیلولر ماحول کے اوسموٹک پریشر، پی ایچ، الیکٹرولائٹس وغیرہ میں تبدیلی کا باعث بنیں گے، اور پھر سیل کی موت کو فروغ دیں گے۔
4. توجہ طلب معاملات
(1) کلچر محلول کو پہلے سے گرم کرنا: کلچر سلوشن، پی بی ایس اور ٹرپسن پر مشتمل بوتل کو پہلے سے گرم کرنے کے لیے 37 ڈگری پانی کے غسل میں ڈالیں۔
(2) الٹرا کلین ورک بینچ اور الٹرا وائلٹ شعاعوں سے شعاع زدہ ہاتھوں کو صاف کرنے کے لیے 75 فیصد الکحل استعمال کریں۔
(3) استعمال شدہ آلات کی درست جگہ کا تعین: کافی آپریٹنگ اسپیس کو یقینی بنائیں، جو نہ صرف چلانے میں آسان ہے بلکہ آلودگی کو بھی کم کرتی ہے۔
(4) الکحل کا لیمپ روشن کریں: نوٹ کریں کہ شعلہ بہت چھوٹا نہیں ہونا چاہئے۔
(5) سخت سیپٹک آپریشن؛
(6) اعتدال پسند خلیات کا عمل انہضام: عمل انہضام کا وقت بہت سے عوامل سے متاثر ہوتا ہے جیسے ہاضمے کے حل کی قسم، تیاری کا وقت، اور کلچر فلاسک میں شامل کی جانے والی مقدار۔ عمل انہضام کے دوران، مہذب خلیوں کی شکل میں ہونے والی تبدیلیوں پر توجہ دی جانی چاہیے۔ ایک بار سائٹوپلازم سکڑنے کے بعد، اگر کنکشن ڈھیلا ہو جائے، یا ٹکڑوں میں تیرنے کے آثار نظر آئیں، تو ہاضمے کو فوری طور پر ختم کر دینا چاہیے۔
(7) گزرے ہوئے خلیوں پر تمام آپریشنز الکحل کے چراغ کے شعلے کے جتنا ممکن ہو قریب ہونے چاہئیں۔ ایک وقت میں صرف ایک سیل کے ساتھ کام کرنا بہتر ہے، ہر سیل کے لیے آلات کا ایک سیٹ استعمال کریں۔ کراس انفیکشن سے بچیں؛
(8) گزرے ہوئے سیل کے بوتل کے منہ کو ہر بار کھولنے یا بند کرنے پر الکحل کے لیمپ پر جراثیم سے پاک کرنے کی ضرورت ہے۔