پی سی آر ٹیکنالوجی

پی سی آر ٹکنالوجی میں مصنوعی طور پر مناسب پرائمر کی ترکیب اور نمونہ ڈی این اے کا ہونا ضروری ہے، اور پھر خودکار تھرمل سائیکلنگ انجام دینا، اور آخر میں مصنوعات کی شناخت اور تجزیہ کرنا۔ فی الحال، پرائمر ڈیزائن اور ترکیب صرف چند تحقیقی اداروں، اداروں اور کلینکوں میں مضبوط تکنیکی طاقت کے ساتھ کی جا سکتی ہے۔ ایپلیکیشن کو کام شروع کرنے کے لیے صرف پی سی آر کا پتہ لگانے والی کٹ خریدنے کی ضرورت ہے۔ پی سی آر خودکار تھرمل سائیکل میں بہت سے متاثر کن عوامل ہیں۔ مختلف ڈی این اے نمونوں کے لیے، پی سی آر کے رد عمل میں شامل مختلف اجزاء کی مقدار اور درجہ حرارت سائیکل کے پیرامیٹرز متضاد ہیں۔

کئی اہم متاثر کن عوامل اب درج ذیل کے طور پر متعارف کرائے گئے ہیں۔

ایک، درجہ حرارت سائیکل پیرامیٹرز

پی سی آر خودکار تھرمل سائیکل میں، سب سے اہم عنصر ڈینیچریشن اور اینیلنگ کا درجہ حرارت ہے۔ جیسا کہ آپریشن کی مثال میں دکھایا گیا ہے، ڈینیچریشن، اینیلنگ اور ایکسٹینشن کی شرائط ہیں: 94℃60s، 37℃60s، 72℃120s، کل 25～30 A سائیکل، ایمپلیفائیڈ فریگمنٹ 500bp ہے۔ یہاں، رد عمل کے مرکب کے مطلوبہ درجہ حرارت تک پہنچنے کے بعد ہر قدم کے وقت کا حساب لگانا چاہیے۔ آٹومیٹک تھرمل سائیکلر میں، مرکب کے اصل درجہ حرارت سے مطلوبہ درجہ حرارت تک کا وقت 30-60 سیکنڈ لیتا ہے، اس وقفے کے وقت کی لمبائی کئی عوامل پر منحصر ہے، بشمول رد عمل ٹیوب کی قسم، دیوار کی موٹائی، رد عمل کے مرکب کا حجم، حرارت ماخذ (پانی کا غسل یا ہیٹنگ بلاک)، اور دو مراحل کے درمیان درجہ حرارت کا فرق، جو تھرمل سائیکل کو ترتیب دیتے وقت مناسب طریقے سے فراہم کیا جانا چاہیے، پر توجہ دیں اور غور کریں، اور ہر آلے پر اصل پیمائش کی جانی چاہیے۔

تھرمل سائیکل کے وقت کے بارے میں ایک اور اہم غور دو پرائمر کے درمیان فاصلہ ہے۔ فاصلہ جتنا زیادہ ہوگا، ہدف کی ترتیب کی پوری لمبائی کی ترکیب میں اتنا ہی زیادہ وقت لگتا ہے۔ اوپر دیا گیا رد عمل کا وقت 500bp کی بہترین ترکیب کی لمبائی پر مبنی ہے جس کا ہدف ترتیب تیار کیا گیا ہے۔ یہاں مختلف درجہ حرارت کے انتخاب کا ایک تعارف ہے۔

1. ٹیمپلیٹ ڈینیچریشن ٹمپریچر ڈینیچریشن ٹمپریچر اس درجہ حرارت کا تعین کرتا ہے جس پر پی سی آر ری ایکشن میں ڈبل سٹرینڈڈ ڈی این اے پگھلتا ہے۔ اگر ڈینیچریشن درجہ حرارت تک نہیں پہنچتا ہے تو، کوئی واحد پھنسے ہوئے DNA ٹیمپلیٹ تیار نہیں ہوگا، اور PCR شروع نہیں ہوگا۔ کم ڈینیچریشن ٹمپریچر کا مطلب ہے نامکمل ڈینیچریشن، ڈی این اے ڈبل سٹرینڈڈ یہ تیزی سے رینیچر ہو جائے گا، اس طرح پیداوار میں کمی آئے گی۔ عام طور پر 90～95℃ ایک بار جب نمونہ اس درجہ حرارت تک پہنچ جاتا ہے، تو اسے جلدی سے اینیلنگ درجہ حرارت پر ٹھنڈا کیا جانا چاہیے۔ ڈی این اے ڈینیچریشن میں صرف چند سیکنڈ لگتے ہیں، اور یہ زیادہ دیر تک ضروری نہیں ہے۔ اس کے برعکس، آپ کو اعلی درجہ حرارت پر اپنی پوری کوشش کرنی چاہیے۔ Taq DNA پولیمریز کی سرگرمی کو برقرار رکھنے کے لیے اسے چھوٹا کریں۔ Taq DNA پولیمریز کو شامل کرنے کے بعد زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت 95 ° C سے زیادہ نہیں ہونا چاہئے۔

2. پرائمر اینیلنگ کا درجہ حرارت اینیلنگ کا درجہ حرارت PCR کی مخصوصیت اور پیداوار کا تعین کرتا ہے۔ اگر درجہ حرارت زیادہ ہے تو، خاصیت مضبوط ہے، لیکن اگر درجہ حرارت بہت زیادہ ہے، تو پرائمر کو ٹیمپلیٹ کے ساتھ مضبوطی سے نہیں ملایا جا سکتا، اور ڈی این اے پروردن کی کارکردگی کم ہو جاتی ہے۔ درجہ حرارت کم ہے، پیداوار زیادہ ہے، لیکن بہت کم پرائمر اور ٹیمپلیٹ کی مماثلت کا سبب بن سکتا ہے، غیر مخصوص مصنوعات میں اضافہ ہوتا ہے۔ عام طور پر، 37 ℃ کے رد عمل کی حالت سے شروع کریں، ایک مخصوص ردعمل کے لیے زیادہ سے زیادہ اینیلنگ درجہ حرارت کا تعین کرنے کے لیے کنٹرول ری ایکشنز کا ایک سلسلہ ترتیب دیں۔ ٹیسٹ کو سمجھنے کے لیے پرائمر کے (G+C)% مواد کی بنیاد پر بھی اس کا اندازہ لگایا جا سکتا ہے جنرل ٹیسٹ کا نقطہ آغاز، اینیلنگ درجہ حرارت Ta (اینیلنگ درجہ حرارت) پگھلنے والے درجہ حرارت سے 5℃ کم ہے۔ ایمپلیفیکیشن پرائمر کا TTm (پگھلنے کا درجہ حرارت)، جس کا حساب فارمولے کے مطابق کیا جا سکتا ہے:

Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃

ان میں، A، T، G، اور C بالترتیب متعلقہ اڈوں کی تعداد کی نمائندگی کرتے ہیں۔ مثال کے طور پر، 20 بیسز کے پرائمر کے لیے، اگر (G+C)% کا مواد 50% ہے، Ta کا نقطہ آغاز 55°C پر سیٹ کیا جا سکتا ہے۔ ایک عام پرائمر ارتکاز (جیسے 0.2μmol/L) میں، اینیلنگ ری ایکشن چند سیکنڈ میں مکمل کیا جا سکتا ہے، اور طویل مدتی اینیلنگ ضروری نہیں ہے۔

3. پرائمر ایکسٹینشن درجہ حرارت کا انتخاب Taq DNA پولیمریز کے بہترین درجہ حرارت پر منحصر ہے۔ عام طور پر 70～75℃، 72℃ پر انزائم کیٹیلائزڈ نیوکلیوٹائڈس کی معیاری شرح 35～100 نیوکلیوٹائڈز/سیکنڈ تک پہنچ سکتی ہے۔ فی منٹ. 1kb کی لمبائی کو بڑھایا جا سکتا ہے، اور اس کی رفتار کا انحصار بفر محلول کی ساخت، پی ایچ ویلیو، نمک کے ارتکاز اور ڈی این اے ٹیمپلیٹ کی نوعیت پر ہے۔ اگر ایمپلیفائیڈ فریگمنٹ 150bp سے چھوٹا ہے، تو ایکسٹینشن سٹیپ کو چھوڑا جا سکتا ہے، اور یہ دوہری درجہ حرارت کا چکر بن جاتا ہے، Taq DNA کی وجہ سے پولیمریز اینیلنگ درجہ حرارت پر مختصر ترتیب کی ترکیب کو مکمل کرنے کے لیے کافی ہے۔ 100 اور 300 bp کے درمیان مختصر ترتیب کے ٹکڑوں کے لیے، تیز اور سادہ دوہری درجہ حرارت سائیکل استعمال کرنا مؤثر ہے۔ اس وقت، پرائمر کی توسیع کا درجہ حرارت اینیلنگ درجہ حرارت جیسا ہی ہے۔ 1kb سے اوپر والے DNA کے ٹکڑوں کے لیے، ایکسٹینشن ٹائم کو ٹکڑے کی لمبائی کے مطابق 1 سے 7 منٹ کے اندر کنٹرول کیا جا سکتا ہے۔ ایک ہی وقت میں، جیلیٹن یا بی ایس اے ریجنٹ کو پی سی آر بفر میں شامل کیا جانا چاہیے تا کہ تاک ڈی این اے پولیمریز کو طویل عرصے تک فعال اور مستحکم رکھا جا سکے۔ جنس؛ 15%-20% گلیسرول تقریباً 2.5kb یا اس سے زیادہ DNA کے ٹکڑوں کو بڑھانے میں مدد کرتا ہے۔

4. روایتی پی سی آر کے سائیکلوں کی تعداد عام طور پر 25 سے 40 سائیکل ہوتی ہے۔ عام غلطی یہ ہے کہ سائیکلوں کی تعداد بہت زیادہ ہے، غیر مخصوص پس منظر سنجیدہ ہے، اور پیچیدگی بڑھ جاتی ہے۔ یقینا، رد عمل کے چکروں کی تعداد بہت کم ہے، اور پیداوار کم ہے۔ لہذا، اس بات کو یقینی بنانا ضروری ہے کہ مصنوعات حاصل کی جائے. شرح کی بنیاد کے تحت، سائیکلوں کی تعداد کو کم سے کم کیا جانا چاہیے۔

امپلیفیکیشن مکمل ہونے کے بعد، نمونے کو 4°C پر ٹھنڈا اور ذخیرہ کیا جاتا ہے۔

2. پرائمر پرائمر ڈیزائن

ٹیمپلیٹ ڈی این اے کو بڑھانے کے لیے، آپ کو پہلے دو oligonucleotide پرائمر ڈیزائن کرنا ہوں گے۔ نام نہاد پرائمر دراصل دو oligonucleotide کے ٹکڑے ہوتے ہیں جو بڑھا دینے کے لیے ہدف DNA کی ترتیب کے تکمیلی ہوتے ہیں۔ دو پرائمر کے درمیان فاصلہ ایمپلیفائیڈ ٹکڑے کی لمبائی کا تعین کرتا ہے۔ , دو پرائمر کے 5' سرے دو 5' ایمپلیفائیڈ پروڈکٹ کے سروں کی پوزیشن کا تعین کرتے ہیں۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ پرائمر پی سی آر ایمپلیفائیڈ ٹکڑوں کی لمبائی، پوزیشن اور نتائج کا تعین کرنے کی کلید ہیں، اور پرائمر ڈیزائن زیادہ اہم ہے۔

پرائمر ڈیزائن کے لیے ضروری شرط یہ ہے کہ پرائمر کے لیے تکمیلی ہدف ڈی این اے کی ترتیب معلوم ہونی چاہیے۔ ضروری نہیں کہ دو پرائمر کے درمیان ترتیب واضح ہو۔ دو معلوم ترتیبیں عام طور پر 15-20 بیسز ہیں، جنہیں ڈی این اے سنتھیسائزر کے ساتھ ترکیب کیا جا سکتا ہے۔ دو تکمیلی پرائمر کے مطابق، اس کے علاوہ، پرائمر ڈیزائن میں عام طور پر جن اصولوں پر عمل کیا جاتا ہے ان میں شامل ہیں:

1. پرائمر کی لمبائی کا شمار اعداد و شمار کے مطابق کیا جاتا ہے، اور انسانی جینوم میں تقریباً 17 بنیادوں پر مشتمل اولیگونوکلیوٹائڈ کی ترتیب ایک بار ظاہر ہونے کا امکان ہے۔ لہذا، پرائمر کی لمبائی عام طور پر 16 نیوکلیوٹائڈز سے کم نہیں ہوتی ہے، اور سب سے زیادہ 30 نیوکلیوٹائڈس سے زیادہ نہیں ہوتی ہے، اور بہترین لمبائی 20-24 نیوکلیوٹائڈز ہوتی ہے۔ اس طرح کے چھوٹے اولیگونوکلیوٹائڈس پولیمرائزیشن درجہ حرارت (72 ° C سے گزرتے ہوئے) پر ایک مستحکم ہائبرڈ نہیں بنائیں گے۔ کبھی کبھی یہ 5 پر ہو سکتا ہے' جین کلوننگ اور دیگر خصوصی ضروریات کو مکمل کرنے کے لیے ایسی ترتیبیں شامل کریں جو ٹیمپلیٹ کے آخر میں تکمیلی نہ ہوں، جیسے کہ پابندی کے انزائم سائٹس یا پروموٹرز؛ پرائمر 5'؛ اینڈ بایوٹین لیبل یا فلوروسینٹ لیبل کو مختلف مقاصد کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے جیسے کہ مائکروبیل کا پتہ لگانا۔

بعض اوقات پرائمر کام نہیں کرتا ہے، وجہ معلوم نہیں ہے، آپ اسے حل کرنے کے لیے پوزیشن کو منتقل کر سکتے ہیں۔

2. (G+C)% مواد کے پرائمر کی ترکیب یکساں ہونی چاہیے، اور ایک ہی بیس پولیمر پر مشتمل ہونے سے بچنے کی کوشش کریں۔ دو پرائمر میں (G+C)% مواد جتنا ممکن ہو ایک جیسا ہونا چاہیے، معلوم ایمپلیفائیڈ فریگمنٹ (G+C) میں % مواد کو اس ٹکڑے کے قریب ہونا چاہیے، عام طور پر 40% سے 60% بہتر ہے۔

3. پرائمر کے اندرونی حصے کو واضح ثانوی ڈھانچے، خاص طور پر بالوں کے پین کے ڈھانچے کی تشکیل سے گریز کرنا چاہیے۔ مثال کے طور پر:

4. پرائمر کے درمیان دو پرائمر کے درمیان کوئی تکمیل نہیں ہونا چاہئے، خاص طور پر 3'؛ پرائمر کے آخر میں۔ یہاں تک کہ اگر اس سے گریز نہیں کیا جا سکتا ہے، 3' end complementary base 2 bases سے زیادہ نہیں ہونا چاہئے، بصورت دیگر"primer dimer"؛ بنانا آسان ہے۔ یا"Primer dimer" (پرائمر ڈائمر)۔ نام نہاد پرائمر ڈائمر بنیادی طور پر ایک دوہرا پھنسا ہوا ڈی این اے ٹکڑا ہے جو ڈی این اے پولیمریز کے عمل کے تحت دوسرے پرائمر کی ترتیب پر ایک پرائمر کی توسیع سے تشکیل پاتا ہے۔ ، پی سی آر کا ایک عام ضمنی پروڈکٹ ہے، اور بعض اوقات اہم پروڈکٹ بھی بن جاتا ہے۔

اس کے علاوہ، دو پرائمر کے درمیان ہم جنس ترتیبوں سے بچیں، خاص طور پر اولیگونیوکلیوٹائڈ کے ٹکڑے جس میں لگاتار 6 سے زیادہ ایک جیسی بنیادیں ہوں، بصورت دیگر دونوں پرائمر ٹیمپلیٹ کی ایک ہی جگہ کے لیے ایک دوسرے سے مقابلہ کریں گے۔ اسی طرح، پرائمر اور ٹارگٹ ڈی این اے کو بڑھایا جانا ہے یا نمونے کے ڈی این اے کی دوسری ترتیبوں میں 6 سے زیادہ بیسز کی ہم جنس ترتیب نہیں ہو سکتی۔ بصورت دیگر، پرائمر دیگر سائٹس سے منسلک ہو جائیں گے، مخصوص ایمپلیفیکیشن کو کم کریں گے اور غیر مخصوص ایمپلیفیکیشن میں اضافہ کریں گے۔

5. پرائمر 3'؛ اینڈ پیئرنگ ڈی این اے پولیمریز پرائمر کے 3'؛ آخر میں ایک نیوکلیوٹائڈ جوڑتا ہے۔ لہٰذا، 3'؛ پرائمر کے اختتام اور ہدف DNA سے 5-6 بیسز کی جوڑی کی ضروریات درست اور سخت ہونی چاہئیں تاکہ مؤثر PCR ایمپلیفیکیشن کو یقینی بنایا جا سکے۔ .

آیا پرائمر ڈیزائن مناسب ہے یا نہیں اس کی تصدیق PCRDESN سافٹ ویئر اور امریکن PRIMER سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے کمپیوٹر کی تلاش سے کی جا سکتی ہے۔

مصنوعی طور پر ترکیب شدہ oligonucleotides کو ترجیحی طور پر کرومیٹوگرافی (chromatography) یا PAGE کے ذریعے پاک کیا جانا چاہیے تاکہ نجاست کو دور کیا جا سکے جیسے کہ چھوٹی زنجیریں جو پوری لمبائی تک ترکیب نہیں کی گئی ہیں۔ 4°C پر 25% acetonitrile محلول میں ذخیرہ شدہ پیوریفائیڈ پرائمر مائکروجنزموں کو روک سکتے ہیں عام حالات میں، غیر استعمال شدہ پرائمر کو -20°C پر فریج میں محفوظ کیا جانا چاہیے۔ پرائمر کو 6 ماہ کے لیے مائع میں ذخیرہ کیا جا سکتا ہے، اور lyophilization کے بعد 1 سے 2 سال تک ذخیرہ کیا جا سکتا ہے۔