جب آپ ابھی فارغ التحصیل ہوئے اور ملازمت میں داخل ہوئے، تو آپ کو اسموں کے ایک گروپ کا سامنا کرنا پڑتا ہے جو حقیقی وقت کے مقداری PCR تجربات کا سامنا کرتے ہیں۔ کیا آپ الجھن میں ہیں کہ کہاں سے شروع کریں؟ ایمپلیفیکیشن وکر، معیاری وکر، حد، CT قدر، پگھلنے والی وکر اور بیس لائن کا کیا مطلب ہے؟ ان تجربات سے فلوروسینٹ تصاویر بہت روشن ہیں، لیکن میں ان کی شناخت نہیں کر سکتا۔ آج، ہم آپ کو ان علم اور تصورات کو دو حصوں میں سیکھنے کے لیے لے جائیں گے: تکنیکی اصطلاحات اور اکثر پوچھے جانے والے سوالات۔
حصہ I پیشہ ورانہ شرائط
1. ایمپلیفیکیشن وکر
ایمپلیفیکیشن وکر سے مراد وہ وکر ہے جہاں سائیکل نمبر abscissa ہے اور ری ایکشن کے دوران ریئل ٹائم فلوروسینس کی شدت PCR کے دوران آرڈینیٹ ہے۔
2. بیس لائن
بیس لائن سے مراد پی سی آر ایمپلیفیکیشن ری ایکشن کے پہلے چند چکروں کے دوران فلوروسینٹ سگنل میں تھوڑی تبدیلی ہے۔ سگنل کی سطح ایک سیدھی لکیر کے قریب دکھائی دیتی ہے، جو کہ بیس لائن ہے۔
3. فلوروسینس تھریشولڈ سیٹنگ
عام طور پر، PCR رد عمل کے پہلے 15 چکروں کے فلوروسینس سگنل کو فلوروسینس بیک گراؤنڈ سگنل کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے، اور فلوروسینس تھریشولڈ PCR کے 3-15 چکروں کے دوران فلوروسینس سگنل کے معیاری انحراف سے 10 گنا زیادہ ہے، اور فلوروسینس تھریشولڈ پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے ایکسپونینشنل مرحلے کے دوران مقرر کیا جاتا ہے۔ عام طور پر، ہر آلے کے استعمال سے پہلے فلوروسینس کی حد ہوتی ہے۔
4. CT قدر
سی ٹی ویلیو ان سائیکلوں کی تعداد کی نمائندگی کرتی ہے جو ہر پی سی آر ری ایکشن ٹیوب کے لیے ہو گی جب فلوروسینٹ سگنل مقررہ حد تک پہنچ جائے گا۔ تحقیق سے، ہم جانتے ہیں کہ ہر ٹیمپلیٹ کی CT ویلیو اور اس ٹیمپلیٹ کے ابتدائی کاپی نمبر کے لوگارتھم کے درمیان ایک خطی تعلق ہے۔ ابتدائی کاپی نمبر جتنا زیادہ ہوگا، CT قدر اتنی ہی کم ہوگی، اور اس کے برعکس۔ معروف ابتدائی کاپی نمبروں کے ساتھ معیارات کا استعمال کرتے ہوئے، ایک انشانکن وکر بنایا جا سکتا ہے جہاں abscissa شروع ہونے والے کاپی نمبر کے لوگارتھم کی نمائندگی کرتا ہے، جبکہ ordinate CT قدر کی نمائندگی کرتا ہے۔ لہذا، جب تک نامعلوم نمونے کی CT قدر حاصل کی جاتی ہے، نمونے کے ابتدائی کاپی نمبر کو معیاری وکر سے شمار کیا جا سکتا ہے۔
زیادہ جانو
یہ فیصلہ کرنے کے لیے کئی اشارے ہیں کہ آیا پروردن وکر اچھا ہے یا نہیں:
جواب: وکر کا انفلیکشن پوائنٹ واضح ہے، خاص طور پر کم بھاری فریکشن کے نمونے کا کفایتی مرحلہ واضح ہے، ایمپلیفیکیشن کریو کی مجموعی ہم آہنگی بہت اچھی ہے، بیس لائن فلیٹ ہے، کوئی بڑھتا ہوا رجحان نہیں ہے، اور ایمپلیفیکیشن نچلی سطح کے ایکسپونینشل فیز حراستی کے نمونے کا وکر بہت اچھا ہے۔ واضح
B: منحنی خطوط کی ڈھلوان ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی کے براہ راست متناسب ہے، ڈھلوان جتنی بڑی ہوگی، ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی اتنی ہی زیادہ ہوگی۔
C: اسٹینڈرڈ بیس لائن فلیٹ یا قدرے کم ہو رہی ہے، جس میں کوئی ظاہری اوپر کی طرف رجحان نہیں ہے۔
D: ہر ٹیوب کے لیے پروردن کے منحنی خطوط کی ہم آہنگی اچھی ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ ہر رد عمل ٹیوب کی ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی یکساں ہے۔
5. پگھلنے والا وکر
جب PCR پروڈکٹ کو گرم کیا جاتا ہے، جیسے جیسے درجہ حرارت بڑھتا ہے، ڈبل پھنسے ہوئے امپلیفیکیشن پروڈکٹ آہستہ آہستہ الگ ہو جاتی ہے، جس کے نتیجے میں فلوروسینس کی شدت میں کمی واقع ہوتی ہے۔ جب ایک خاص درجہ حرارت تک پہنچ جاتا ہے تو، مصنوعات کی ایک بڑی مقدار الگ ہوجاتی ہے، جس کے نتیجے میں فلوروسینس میں تیزی سے کمی واقع ہوتی ہے۔ مختلف پی سی آر پروڈکٹس کے لیے مختلف ٹی ایم ویلیوز کے ساتھ اس فنکشن کا استعمال اس درجہ حرارت میں بھی فرق رکھتا ہے جس پر فلوروسینٹ سگنل تیزی سے کم ہوتا ہے، جو کہ پی سی آر کی مخصوصیت کو پہچاننے کا ایک اچھا طریقہ ہو سکتا ہے۔
6. پگھلنے والا وکر (لوگارتھمک وکر کا استعمال کرتے ہوئے)
چوٹی کا گراف پگھلنے والے منحنی خطوط کے ذریعہ تشکیل دیا جاتا ہے تاکہ مصنوعات کے ٹکڑوں کی صورتحال کو زیادہ بدیہی طور پر ظاہر کیا جاسکے۔ چونکہ پگھلنے کا درجہ حرارت DNA ٹکڑے کی TM قدر ہے، اس لیے DNA ٹکڑے کی TM قدر کو متاثر کرنے والے کچھ پیرامیٹرز کا تعین کیا جا سکتا ہے، جیسے کہ ٹکڑے کا سائز، GC مواد وغیرہ۔ عام طور پر، ہمارے پرائمر ڈیزائن کے اصول کے مطابق، یہ عام طور پر کہا جاتا ہے۔ کہ ایمپلیفائیڈ پروڈکٹ کی لمبائی 80-300bp کی حد میں ہے، اور پگھلنے کا درجہ حرارت 80 ڈگری اور 90 ڈگری کے درمیان ہونا چاہیے۔
A: اگر 80 ڈگری اور 90 ڈگری کے درمیان صرف ایک اہم چوٹی ہے، تو اس کا مطلب ہے کہ اصل وقت کا پی سی آر کامل ہے۔
B: اگر مرکزی چوٹی 80 ڈگری اور 90 ڈگری کے درمیان ظاہر ہوتی ہے، اور ناپاکی کی چوٹی 80 ڈگری سے نیچے ظاہر ہوتی ہے، تو بنیادی طور پر پرائمر ڈائمر سمجھا جاتا ہے۔ اینیلنگ درجہ حرارت کو بڑھا کر حل کرنے کی کوشش کرنے کا یہ ایک اچھا آپشن ہے۔
C: اگر مرکزی چوٹی 80 ڈگری اور 90 ڈگری کے درمیان ظاہر ہوتی ہے، اور درجہ حرارت بڑھنے پر ایک آوارہ چوٹی ظاہر ہوتی ہے، تو بنیادی طور پر ڈی این اے کی آلودگی کو سمجھا جاتا ہے۔ اور ڈی این اے کو تجربے کے ابتدائی مراحل میں نکالنے کی ضرورت ہے۔
7. معیاری وکر لائن
معیاری معیارات کو مختلف ارتکاز میں گھٹا دیا گیا اور پی سی آر کے رد عمل کے لیے ٹیمپلیٹس کے طور پر استعمال کیا گیا۔ معیاری منحنی خطوط معیاری کاپی نمبر کے لوگارتھم کے ساتھ بطور abscissa اور ماپا گیا CT قدر کو ordinate کے طور پر بنایا گیا ہے۔ نامعلوم نمونے کی مقدار درست کرتے وقت، نمونے کا کاپی نمبر نامعلوم نمونے کی CT قدر کی بنیاد پر معیاری وکر سے حاصل کیا جا سکتا ہے۔ معیاری منحنی خطوط مطلق مقدار کے لیے بہت اہم ہیں۔
دوسرا حصہ. عام مسئلہ
Q1: RT-PCR، QPCR، ریئل ٹائم PCR اور ریئل ٹائم RT-PCR میں کیا فرق ہے؟
A1: RT-PCR ریورس ٹرانسکرپشن PCR ہے، جو کہ پولیمریز چین ری ایکشن کا وسیع پیمانے پر استعمال ہونے والا ویرینٹ ہے۔ RT-PCR میں، RNA اسٹرینڈ کو تکمیلی DNA میں الٹا نقل کیا جاتا ہے، جسے پھر PCR کے ذریعے DNA کو بڑھانے کے لیے PCR کے سانچے کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔
ریئل ٹائم پی سی آر اور کیو پی سی آر ایک ہی چیز ہیں، دونوں ریئل ٹائم مقداری پی سی آر ہیں، جس کا مطلب ہے کہ پی سی آر کے عمل کے دوران ہر سائیکل پر ڈیٹا کی ریئل ٹائم ریکارڈنگ ہوتی ہے۔ اس طرح سے اسٹارٹ اپ ٹیمپلیٹس کی تعداد کا ٹھیک ٹھیک تجزیہ کیا جا سکتا ہے۔
اگرچہ ریئل ٹائم پی سی آر اور ریورس ٹرانسکرپشن پی سی آر دونوں کو مختصراً RT-PCR کہا جاتا ہے، بین الاقوامی کنونشن یہ ہے کہ RT-PCR خاص طور پر ریورس ٹرانسکرپشن PCR سے مراد ہے، جبکہ ریئل ٹائم پی سی آر کو اکثر مختصراً qPCR (مقدار اصلی- حقیقی حقیقی حقیقی حقیقی پی سی آر) - ٹائم پی سی آر)۔
ریئل ٹائم RT-PCR (RT-QPCR) ریورس ٹرانسکرپشن PCR کی ایک قسم ہے جو فلوروسینٹ مقداری تکنیکوں کو یکجا کرتی ہے: cDNA (RT) حاصل کرنے کے لیے RNA سے پہلے ریورس ٹرانسکرپشن، اس کے بعد ریئل ٹائم PCR (QPCR) کا استعمال کرتے ہوئے مقداری تجزیہ کیا جاتا ہے۔
Q2: فلوروسینٹ مقداری PCR کے ایمپلیفائیڈ پروڈکٹ کے ٹکڑے کی لمبائی کو 80-300bp کی حد میں کیوں کنٹرول کیا جاتا ہے؟
A2: ہر جین کی ترتیب کی لمبائی مختلف ہوتی ہے، ان میں سے کچھ کئی Kb اور سینکڑوں BP ہوتے ہیں۔ تاہم، جب ہم پرائمر ڈیزائن کرتے ہیں، تو ہمیں صرف پروڈکٹ کی لمبائی 80-300bp کی ضرورت ہوتی ہے، اور بہت چھوٹا یا بہت لمبا مقداری PCR کا پتہ لگانے کے لیے موزوں نہیں ہے۔
پروڈکٹ کے ٹکڑے پرائمر ڈائمرز سے ممتاز کرنے کے لیے بہت چھوٹے ہیں۔ پرائمر ڈائمر کی لمبائی تقریباً 30-40bp ہوتی ہے، جب یہ 80bp سے کم ہوتی ہے، تو یہ فرق کرنا مشکل ہوتا ہے کہ یہ پرائمر ڈائمر ہے یا پروڈکٹ۔ اگر پروڈکٹ کا ٹکڑا بہت لمبا ہے، 300bp سے زیادہ ہے، تو یہ آسانی سے کم امپلیفیکیشن کی کارکردگی کا باعث بنے گا، اور جین کی مقدار کا مؤثر طریقے سے پتہ نہیں لگایا جا سکتا۔
مثال کے طور پر، جب آپ کلاس روم میں لوگوں کی تعداد گنتے ہیں، تو آپ کو صرف یہ گننا ہوگا کہ وہاں کتنے منہ ہیں۔ جین کی جانچ کرتے وقت بھی ایسا ہی ہوتا ہے۔ پوری ترتیب کی نمائندگی کرنے کے لیے آپ کو صرف ایک جین کی ایک خاص ترتیب کا پتہ لگانے کی ضرورت ہے۔ غلطی کرنا آسان ہے اگر آپ لوگوں کو گننے کے لیے منہ اور ناک، کان اور چشمے دونوں کو گن رہے ہیں۔
Q3: پرائمر ڈیزائن کے لئے زیادہ سے زیادہ لمبائی کیا ہے؟
A3: عام طور پر، 20-24bp کی حد میں پرائمر کی لمبائی اچھی ہوتی ہے۔ بلاشبہ، ہمیں پرائمر کو ڈیزائن کرتے وقت پرائمر کی ٹی ایم ویلیو پر توجہ دینی چاہیے، کیونکہ یہ اینیلنگ کے بہترین درجہ حرارت سے متعلق ہے۔ کافی تجربات کے بعد یہ ثابت ہوا ہے کہ 60 ڈگری ایک اچھی ٹی ایم ویلیو ہے۔ اینیلنگ کا کم درجہ حرارت آسانی سے غیر مخصوص امپلیفیکیشن کا باعث بن سکتا ہے، جبکہ اعلی اینیلنگ درجہ حرارت عام طور پر کم ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی، ایمپلیفیکیشن کریو کی دیر سے چوٹی اور تاخیر سے ہونے والی CT قدر کا باعث بنتا ہے۔
سوال 4: کیا جمع کردہ نمونے کی مقدار تجرباتی نتائج کو متاثر کرتی ہے؟
A4: نہیں، ظاہر ہے، جتنے زیادہ نمونے اکٹھے کیے جائیں گے، جتنے زیادہ RNA نکالے جائیں گے، اتنے ہی زیادہ cDNA، اور اتنے ہی زیادہ ہدف کے ٹکڑے ہوں گے۔ مطلق مقدار کے لیے، ہدف کے ٹکڑے کی کاپی نمبر کا حساب لگانا ضروری ہے، اور جمع کیے گئے نمونے کی مقدار یقینی طور پر تجرباتی نتائج کو متاثر کرے گی۔ مثال کے طور پر، خون میں ہیپاٹائٹس سی وائرس HBV کا پتہ لگانا خون کی ایک مخصوص مقدار (1ml) میں HBV مواد کا پتہ لگانا ہے۔
عام طور پر سائنسی تحقیق میں استعمال ہونے والی نسبتہ مقدار کے لیے، نمونوں کی تعداد کا تجرباتی نتائج سے کوئی تعلق نہیں ہے، کیونکہ رشتہ دار مقدار کا مطلب ہدف جین اور حوالہ جین کے درمیان موازنہ ہے۔ بس براہ کرم انہیں ایک ہی نیوکلک ایسڈ اسٹرینڈ میں موجود اپ اسٹریم اور ڈاون اسٹریم کے ٹکڑے سمجھیں۔ اگر نمونہ کا سائز بڑا ہے، تو حوالہ اور ہدف کے جین دونوں کو ایک ہی وقت میں برابر تناسب میں بڑھایا جاتا ہے، جو نتائج پر اثر انداز نہیں ہوتا ہے۔
Q5: کیا ریورس ٹرانسکرپٹیس کی کارکردگی تجرباتی نتائج کو متاثر کرے گی؟
A5: اوپر کی طرح۔ نوٹ کریں کہ ہم اعلی RT کارکردگی چاہتے ہیں، لیکن ہم ترجیح دیتے ہیں کہ RT انزائم نسبتاً مستحکم ہو اور یکساں نتائج حاصل کرے۔ یہ بڑی کمپنیوں کے ریورس ٹرانسکرپشن سویٹس کی بہترین صلاحیتوں کا امتحان ہوگا۔
سوال 6: کیا TAQ انزائم کی کارکردگی تجرباتی نتائج کو متاثر کرتی ہے؟
A6: TAQ انزائم کی کارکردگی نسبتاً بڑی ہے۔ عام طور پر، ہاٹ اسٹارٹ ٹاک انزائمز کی ضرورت ہوتی ہے اور نسبتاً موثر ہوتے ہیں۔ تجارتی فلوروسینس مقداری کٹس کے لیے، ہر مینوفیکچرر 100 فیصد کے قریب اپنی مصنوعات کے مطابق بہترین حالت کی کارکردگی کو بہتر بنائے گا، اگر کارکردگی بہت کم ہے، تو تجرباتی نتائج حاصل نہیں کیے جا سکتے۔ مختلف کمپنیوں کی مصنوعات کے لیے، یہ معیار کا ایک پیمانہ ہے۔
سوال 7: کیا فلوروسینٹ ڈائی کی مقدار تجرباتی نتائج کو متاثر کرتی ہے؟
A7: ہاں، یہ ہوگا۔ اگر فلوروکروم بہت سیر ہو تو یہ کچھ آلات میں شور کی مداخلت کا سبب بن سکتا ہے۔ اگر فلورو کروم سیر نہیں ہے، اور فلوروسینس ویلیو بہت کم ہے، تو یہ سطح مرتفع کے مرحلے میں جلد داخل ہو جائے گا اور ایمپلیفیکیشن کریو فلیٹ ہو گا۔ فلوروسینس مقداری تجربے میں، CT قدر بنیادی طور پر دیکھی جاتی ہے، اس لیے پلیٹاو اسٹیج میں داخل ہونے کے لیے دیر سے ایمپلیفیکیشن وکر کے لیے یہ اہم نہیں ہے، لیکن تصویر کافی خوبصورت نہیں ہے۔ اگر آپ کو انتخاب کرنا تھا تو، فلورو کروم کو منتخب کرکے شروع کریں جو قدرے کم سیر ہو۔ تاہم، جب ایک ہی کمپنی کی ایک ہی مصنوعات کا استعمال کرتے ہیں، تو اس کا اثر بنیادی طور پر نہ ہونے کے برابر ہوتا ہے۔
سوال 8: کیا پی سی آر ٹیوب کی ترسیل تجرباتی نتائج کو متاثر کرے گی؟
A8: ہاں۔ تاہم، ایک ہی مینوفیکچرر سے استعمال کی اشیاء کے ایک ہی بیچ کے لیے، اس اثر کو نظر انداز کیا جا سکتا ہے۔ یہ ایک اچھا انتخاب ہے اور استعمال کی جانے والی اشیاء کی روشنی کی ترسیل کے اثر کو کم کرنے کے لیے ایک اعلیٰ پارگمیتا جھلی کے ساتھ اچھی پلیٹ کا استعمال کرنا بہتر ہے۔
Q9: کیا آپریشن کے دوران غلطیاں تجرباتی نتائج کو متاثر کریں گی؟
A9: آپریشن کے عمل کا اثر بنیادی طور پر یکسانیت میں ظاہر ہوتا ہے۔ یکسانیت کا مطلب یہ ہے کہ نظام کے تمام اجزاء یکساں طور پر آپس میں ملے ہوئے ہیں، اور فلیش سینٹرفیوگریشن اس مسئلے کو حل کر سکتی ہے۔ اس کے علاوہ، ابتدائی افراد کے لیے، پی سی آر سسٹم کو 20 انچ سے زیادہ کے لیے ایڈجسٹ کرنا بہتر ہے، اور ایسا نظام جو بہت چھوٹا ہے اس میں غلطیوں کا زیادہ خطرہ ہوتا ہے۔ اگر اینیلنگ درجہ حرارت کو صحیح طریقے سے بہتر بنایا گیا ہے تو، CT پر پرائمر کی حراستی کا اثر کم سے کم ہو جاتا ہے۔ اور آپ جان لیں گے کہ کچھ آپریشنل غلطیوں (جیسے پرائمر کی حراستی) کو اینیلنگ درجہ حرارت کو بہتر بنا کر بچا جا سکتا ہے۔
خلاصہ کریں۔
مندرجہ بالا کچھ سوالات اور سوالات ہیں جو نوزائیدہوں کو تجربے کے دوران اکثر پیش آتے ہیں، ہمیں امید ہے کہ یہ سوالات آپ کو کچھ الجھنوں کو دور کرنے میں مدد کر سکتے ہیں۔ تجربہ افراتفری پیدا کرنے اور مسائل کو حل کرنے کا عمل ہے، امید ہے کہ آپ کو اس سے کچھ حاصل ہوگا۔ پڑھنے کے لئے شکریہ اور ہم آپ کو اگلی بار دیکھیں گے!
