کنفوکل امیجنگ - شیشے کے نیچے کے برتنوں میں سیلز کو کیسے بہتر بنایا جائے۔

مارکیٹ میں عام شیشے کے نیچے والی پیٹری ڈشز کے لیے، عام طور پر پلاسٹک کی پیٹری ڈش کے نچلے حصے میں ایک سوراخ کیا جاتا ہے، اور پھر ایک کور گلاس یا سیل سلائیڈ جس کی موٹائی 170-220 μm ہوتی ہے اس کے نیچے چپکائی جاتی ہے۔ شیڈولیس گلو یا سیلیکا جیل کے ساتھ پیٹری ڈش۔ پیٹری ڈش کا پورا نچلا حصہ شیشے کا نہیں ہے۔ مشاہدے کے لیے موزوں علاقہ صرف سوراخ کے علاقے میں ہے۔ تاہم، شیشے کی ہائیڈرو فوبیکیٹی کی وجہ سے، خلیات کی ثقافت کرتے وقت، خلیے شیشے کے ساتھ اچھی طرح نہیں چل سکتے، اور نشوونما کی حالت اچھی نہیں ہے، اور یہاں تک کہ سیل ڈیلامینیشن کا واقعہ کنفوکل اسکیننگ امیجنگ کے دوران ہوتا ہے۔

خلیات کو اچھی طرح سے چپکنے کے لیے، اس بات کی تصدیق کرنا ضروری ہے کہ سیل کلچر کے لیے شیشے کے نیچے والے برتنوں کو استعمال کرنے سے پہلے مخصوص پروٹین ریجنٹس کو لیپت کیا گیا ہے۔

لحاف خود کریں

مختلف سیل ثقافتوں کو مختلف کوٹنگ ری ایجنٹس کی ضرورت ہوتی ہے۔ ایک ہی وقت میں، کیونکہ کوٹنگ کے لیے استعمال ہونے والا پروٹین ایک حیاتیاتی مصنوعات ہے، اس لیے مختلف کمپنیوں کے کوٹنگ پروٹین کی مصنوعات کی پاکیزگی اور خوراک مختلف ہوتی ہے۔ یہ تکنیکی پوسٹ صرف حوالہ کے لیے ہے۔ کوٹنگ ری ایجنٹس کی مخصوص خوراک کو استعمال شدہ برانڈز کی ہدایات کا حوالہ دینا چاہیے۔ . اور بہترین کوٹنگ کی ارتکاز تلاش کرنے کے لیے آپ جو ری ایجنٹس استعمال کرتے ہیں ان کے ساتھ تدریجی تجربہ کرنا بہتر ہے۔

Poly-L-Lysine (PLL, sigma, P4832, 100ug/ml) کی ایک مثال یہ ہے:

PLL کوٹنگ خلیات کی اکثریت کے لیے موزوں ہے، خاص طور پر مرکزی نظام میں نیوران کی ثقافت کے لیے۔ استعمال کے دوران مطلوبہ مقدار تک پہنچنے کے لیے پروٹین کا مواد (ug/cm2) فی یونٹ رقبہ بنانا ضروری ہے۔ اس مثال میں PLL کے لیے کوٹنگ کی تجویز کردہ مقدار 2 ug/cm2 ہے۔ کوٹنگ کے علاقے اور کوٹنگ کے حجم کے مطابق ضروری پروٹین کی مقدار کا حساب لگانا ضروری ہے۔

مثال کے طور پر: 35 ملی میٹر شیشے کے نیچے والی پیٹری ڈش، سیل کی نشوونما کا رقبہ 3.5cm2 ہے، کوٹنگ کا رقبہ 4.1cm2 ہے، اور کوٹنگ سلوشن کا حجم 400ul ہے، پھر تجویز کردہ خوراک 2ug/cm2 ہے۔ پھر ایک کنویں میں 8.2 ug PLL کی ضرورت ہے۔ اگر صرف 400 ul PLL محلول شامل کیا جائے تو PLL محلول کا ارتکاز 20.5 ug/ml (تقریباً 20 ug/ml) ہے۔ لہذا، اسٹاک حل کو انتہائی صاف پانی سے پتلا کرنے کی ضرورت ہے۔

مخصوص اقدامات:

1. PLL سٹاک محلول 1:5 کو انتہائی صاف پانی سے پتلا کریں۔

2. ہر 35 ملی میٹر شیشے کے نیچے والی پیٹری ڈش میں 400 یو ایل پی ایل ایل ڈائلیشن شامل کریں۔

3. کمرے کے درجہ حرارت پر 1-2 گھنٹے تک انکیوبیٹ کریں اور پی ایل ایل کو کم کریں۔

4. احتیاط سے 2 ملی لیٹر پی بی ایس محلول یا سیرم فری میڈیم سے 3 بار دھوئیں، اور واش محلول کو ایسپریٹ کریں۔

5. کاشت کے لیے سیل سسپنشن کو براہ راست شامل کریں۔

طریقہ تشخیص

مختلف کوٹنگ پروٹین کی مختلف خصوصیات کی وجہ سے، مختلف کوٹنگ پروٹین مختلف طریقوں سے استعمال ہوتے ہیں۔ شیشے کے نیچے والے برتنوں کو کوٹ کرنے کی ضرورت کی وجہ سے اکثر نئی آلودگی پیدا ہوتی ہے۔ مزید برآں، خلیات کے اٹھائے جانے کے بعد آلودگی اکثر دریافت ہوتی ہے، جس سے نہ صرف وقت میں تاخیر ہوتی ہے، بلکہ کٹ کے استعمال کی اشیاء بھی ضائع ہوتی ہیں۔ بہر حال، لیپت پروٹین ری ایجنٹس اور معیار کی یقین دہانی شدہ شیشے کے نیچے والے برتن مہنگے ہوتے ہیں (خراب معیار کے شیشے کے نیچے والے پکوان اس لیے رس سکتے ہیں کیونکہ گلو چپچپا نہیں ہوتا یا استعمال ہونے والا گوند خلیوں کے لیے زہریلا ہوتا ہے)۔

کوٹنگ کے بغیر کنفوکل پیٹری ڈشز

جو بچے وقت اور محنت بچانا چاہتے ہیں، ان کے لیے بغیر کوٹنگ کے کنفوکل کلچر ڈشز کا استعمال زیادہ آسان ہے۔

مناسب کلچر ڈش کا انتخاب کرتے وقت جن عوامل پر غور کرنا چاہیے وہ یہ ہیں: آیا یہ آپ کے اپنے سیلز کے لیے موزوں ہے یا نہیں، کیا کلچر ڈش کی آپٹیکل خصوصیات کنفوکل کی ضروریات کو پورا کرتی ہیں۔

پیٹری ڈشز جو مندرجہ بالا عوامل کی ضروریات کو پورا کرتی ہیں وہ شیشے کے نیچے والے برتنوں تک محدود نہیں ہیں۔ درحقیقت، ہر کوئی جانتا ہے کہ پلاسٹک کے برتن شیشے کے مقابلے میں سستے اور خلیات کے لیے آسان ہوتے ہیں۔ یہاں شنگھائی جنگان کی ایک کنفوکل کلچر ڈش کی ایک مثال ہے، ان پیرامیٹرز کے بارے میں بات کرنے کے لیے جو ایک ثقافتی ڈش جو کنفوکل تجربات کے لیے موزوں ہے اس کی ضرورت ہے:

یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ کنفوکل کلچر ڈشز کے جسمانی پیرامیٹرز جو براہ راست استعمال کی ضروریات کو پورا کرتے ہیں شیشے کے بہت قریب ہوتے ہیں، لیکن ساتھ ہی، ان میں ہائیڈرو فیلک خصوصیات بھی ہوتی ہیں، جو زیادہ تر خلیات کو بہتر طریقے سے قائم رکھ سکتی ہیں۔ اور لچک شیشے سے بہتر ہے۔ یہ زیادہ تر سیل لائنوں اور بنیادی خلیوں کو براہ راست دیوار سے چپکنے کی اجازت دیتا ہے، اور یہ نازک نہیں ہے، جو کہ ایک اچھا انتخاب ہے۔

آپ اپنی مخصوص تجرباتی ضروریات اور مندرجہ بالا جدول میں دیے گئے پیرامیٹرز کے مطابق اپنے تجربے کے لیے موزوں ترین کنفوکل کلچر ڈش بھی تلاش کر سکتے ہیں۔

طریقہ تشخیص

اس قسم کی پیٹری ڈش کا انتخاب کرنے کے لیے اضافی کوٹنگ کی ضرورت نہیں ہوتی، جس سے آلودگی کے خطرے کو بہت کم کیا جاتا ہے۔ اور چونکہ پلاسٹک کے نچلے حصے کے ساتھ کام کرنا آسان ہے، اس لیے اسے پیٹری ڈش کے نیچے تک ٹھیک کرنے کے لیے کسی گوند کی ضرورت نہیں ہے۔ رساو یا cytotoxicity کے امکان کو ختم کریں۔